Peter Parker (Tobey Maguire) conseguiu encontrar um meio-termo entre seus deveres como o Homem-Aranha e seu relacionamento com Mary Jane (Kirsten Dunst). Porém, o sucesso como herói e a bajulação dos fãs, entre eles Gwen Stacy (Bryce Dallas Howard), faz com que Peter se torne auto-confiante demais e passe a negligenciar as pessoas que se importam com ele. De repente, seu melhor amigo Harry (James Franco) quer vingança porque o Homem-Aranha "matou" seu pai Norman, o Duende Verde, quando na verdade Norman se suicidou acidentalmente. Harry Osborn se torna o novo Duende Verde mas perde a memória de que Peter é o Homem-Aranha e o considera como seu melhor amigo.
Mas a situação muda drasticamente quando ele precisa enfrentar Flint Marko (Thomas Haden Church), mais conhecido como o Homem-Areia, que possui ligações com a morte do seu tio Ben. Tendo que lidar com o sentimento de vingança, Peter passa a usar um estranho uniforme negro, que se adapta ao seu corpo, mal sabe ele que esse uniforme na verdade é um simbionte, que se aproveitou da raiva que Peter sentia pelo Homem-Areia, e possuiu seu traje, dando a ele uma maneira mais perversa de combater o crime. Enquanto isso, Harry recupera sua memória de que Peter é o Homem-Aranha, e arma um plano contra ele, e sai quase morto de uma luta contra Peter e o simbionte.
Depois que Peter vê que o simbionte está mudando seu comportamento, ele o larga. Porém, a criatura cai sobre o fotógrafo e inimigo de Peter, Eddie Brock (Topher Grace). Ele se transforma em Venom. O Homem-Areia se une a Venom para matar o Homem-Aranha. Para isso, eles seqüestram Mary Jane para atraí-lo. O Homem-Aranha vai até lá e é atingido por Homem-Areia, agora transformado em gigante. Enquanto não consegue sair de lá (pois está preso pelo pescoço pela teia de Venom), Harry finalmente descobre a verdade sobre a morte do seu pai, Norman Osborn, pelo seu mordomo Bernard e decide ajudar o Homem-Aranha quando ele está quase morto. Juntos, eles derrotam o Homem-Areia e salvam Mary Jane.
Mas Venom amarra o Homem-Aranha e em seguida captura o planador de Harry, com o objetivo de perfurá-lo com ele. De repente, Harry se coloca na frente do Homem-Aranha, e é morto em seu lugar. Peter acidentalmente descobre o ponto fraco de Venom, e consegue tirar Eddie dele. Ao tentar destruir o sibionte com uma das bombas de Harry, Eddie se joga para tentar salvá-lo, e aparentemente morre junto com ele. O Homem-Areia aparece e explica a Peter que não teve realmente a intenção de matar seu tio, e que se arrepende muito disso. Peter o perdoa e então o Homem-Areia desaparece. Agora sem nenhum inimigo por derrotar, Peter e Mary Jane acompanham o último suspiro de Harry, prestes a morrer. No final do filme aparece Peter Parker e Mary Jane dançando juntos em um restaurante.